細(xì)胞培養(yǎng)與內(nèi)毒素

我們常說(shuō)，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，在選購(gòu)血清的時(shí)候，一定要關(guān)注血清的“內(nèi)毒素指標(biāo)"，同時(shí)，內(nèi)毒素含量也是劃分血清等級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)之一。

(目前，由于同一廠家，不同批次的血清，內(nèi)毒素?cái)?shù)值也可能有較大差異，因此很多血清廠家在名稱上已不注明級(jí)別。但使用者仍可通過(guò)檢測(cè)報(bào)告，自行甄別挑選。)

那這血清中內(nèi)毒素的高低對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)會(huì)有啥影響??？為什么選血清要選內(nèi)毒素含量低的呢？

所以今天我們就來(lái)聊聊，細(xì)胞培養(yǎng)中血清的內(nèi)毒素問(wèn)題。

01

人體對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素極為敏感

極微量（1-5ng/kg，而1ng≈2.5EU）內(nèi)毒素就能引起體溫上升，發(fā)熱反應(yīng)持續(xù)約4小時(shí)后逐漸消退。

自然感染時(shí)，因革蘭氏陰性菌不斷生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)伴有陸續(xù)死亡、釋出內(nèi)毒素，故發(fā)熱反應(yīng)將持續(xù)至體內(nèi)病原菌*消滅為止。

內(nèi)毒素引起發(fā)熱反應(yīng)的原因是內(nèi)毒素作用于體內(nèi)的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，使之產(chǎn)生IL-1、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子作用于宿主下丘腦的體溫調(diào)節(jié)中樞，促使體溫升高發(fā)熱。

由于內(nèi)毒素是細(xì)菌死亡裂解或自溶引起的，因此環(huán)境中大量存在內(nèi)毒素。但是如果在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，出現(xiàn)了大量?jī)?nèi)毒素，而細(xì)胞要用于某些疾病的治療，回輸人體，這是萬(wàn)萬(wàn)不行的。

02

內(nèi)毒素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響

細(xì)胞遺傳代謝的影響

此前，有人做過(guò)實(shí)驗(yàn)，來(lái)觀察內(nèi)毒素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響，記錄的影響包括：刺激白細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生組織因子、激活鼠巨噬細(xì)胞，以及通過(guò)極低水平（低于 1 ng/mL）的內(nèi)毒素抑制鼠類紅細(xì)胞集落形成等一系列指標(biāo)。

隨后，發(fā)表了許多關(guān)于內(nèi)毒素對(duì)體外細(xì)胞功能和生長(zhǎng)影響的論文。

Morris等人發(fā)現(xiàn)（1），只需暴露 6 小時(shí)，低至 0.5 ng/mL 的內(nèi)毒素水平可以增加馬腹膜巨噬細(xì)胞中IL-6的產(chǎn)生。Mattern等人發(fā)現(xiàn)（2）， 100 ng/mL 內(nèi)毒素可以刺激人類 T 細(xì)胞的增殖及其淋巴因子的產(chǎn)生，但這種刺激需要與先前暴露于內(nèi)毒素的單核細(xì)胞直接物理接觸。Sibley等人報(bào)道，10 到 200 ng/mL 內(nèi)毒素刺激鼠 B 細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系 (70Z/3) 完成 IgM 的產(chǎn)生，然后在細(xì)胞表面表達(dá)（3）。

從現(xiàn)有的研究可以看出，內(nèi)毒素對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)影響還是很大的：

• 改變細(xì)胞外形

• 活化細(xì)胞，產(chǎn)生訊息傳遞物質(zhì)

• 抑制酶活性

• 抑制人工受精的成功率等

血清中內(nèi)毒素含量過(guò)高，更容易導(dǎo)致細(xì)胞“亞健康"，造成數(shù)據(jù)不準(zhǔn)，或細(xì)胞狀態(tài)不良、老化、甚至死亡，導(dǎo)致試驗(yàn)中斷失敗。所以要盡量選擇內(nèi)毒素低的血清。

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

內(nèi)毒素會(huì)加速細(xì)胞衰老、凋亡，細(xì)胞提前死亡，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)產(chǎn)生波動(dòng)。

參考文獻(xiàn)：

1.Morris,D.D., Crowe, N., Moore, J.N.and Moldawer, L.L. Endotoxin-Induced Production ofInterleukin 6 by Equine Peritoneal Macrophages In Vitro. Am. J. Vet. Res.53:1298-1301 (1992).

2.Mattern, T.,Thanhauser, A., Reiling, N.,Toellner, K., Duchrow, M., Kusumoto, S.,Rietschel,E.T., Ernst, M., Brade, H.,Flad, H.D. and Ulmer, A.J. Endotoxin and Lipid A StimulateProliferation of Human T Cells In the Presence of Autologous Monocytes. J.Immunol. 153:2996-3004(1994).

3.Sibley, C.H.,Terry, A. and Raetz, C.R.H.Induction of K Light Chain Synthesis in 70Z/3 BLymphoma Cells by Chemically Defined Lipid A Precursors. J. Biol. Chem.263:5098-5103 (1988).

03

選擇內(nèi)毒素低的優(yōu)質(zhì)血清

一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞或組織培養(yǎng)過(guò)程中內(nèi)毒素污染源通常來(lái)自于血清、培養(yǎng)液及外加藥物配制用水等。

所以選擇內(nèi)毒素含量低的優(yōu)質(zhì)血清就顯得尤為重要。

以下幾類情況更應(yīng)關(guān)注內(nèi)毒素的影響：

1、養(yǎng)干細(xì)胞時(shí)，干細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素非常敏感，如果血清中內(nèi)毒素≥3EU/ml時(shí)，干細(xì)胞很容易死亡。

2、養(yǎng)免疫細(xì)胞時(shí)，過(guò)高的內(nèi)毒素可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞釋放炎癥因子，抑制小鼠紅細(xì)胞集落的形成等。

3、基因敲除相關(guān)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)的細(xì)胞要盡可能保持其原始狀態(tài)，任何引導(dǎo)細(xì)胞衰老或凋亡的試劑，都會(huì)讓后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果“失之毫厘，謬以千里"。在準(zhǔn)備血清和其他試劑時(shí)，選擇極低的內(nèi)毒素（最好≤1EU/ml），對(duì)實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。

4、原代培養(yǎng)、雜交瘤融合、細(xì)胞轉(zhuǎn)染，或者肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮等難養(yǎng)細(xì)胞的擴(kuò)增，這些都需要挑選好的血清給細(xì)胞以有力支持。因此，挑選更低的內(nèi)毒素，是保證實(shí)驗(yàn)順利的第一步。

5、實(shí)驗(yàn)室有些細(xì)胞，需要長(zhǎng)期培養(yǎng)、長(zhǎng)期凍存，或者經(jīng)常復(fù)蘇、經(jīng)常培養(yǎng)的，血清會(huì)經(jīng)?；蜷L(zhǎng)時(shí)間作用于細(xì)胞。為保證細(xì)胞的健康，都應(yīng)該選用更低內(nèi)毒素的血清，以避免內(nèi)毒素長(zhǎng)久對(duì)細(xì)胞的毒性影響。

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Ausbian進(jìn)口特級(jí)胎牛血清

內(nèi)毒素≤3EU/ml

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