一、細(xì)胞培養(yǎng)的核心目標(biāo)

細(xì)胞培養(yǎng)的本質(zhì)是在體外為細(xì)胞提供一個(gè)接近體內(nèi)的生存環(huán)境，使其能夠：

1. 存活：保持良好的生理狀態(tài)。

2. 增殖：在可控條件下穩(wěn)定生長(zhǎng)。

3. 可重復(fù)實(shí)驗(yàn)：為后續(xù)實(shí)驗(yàn)（如藥物處理、轉(zhuǎn)染、蛋白表達(dá)等）提供可靠的細(xì)胞模型。

二、細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

1. 溫度與氣體環(huán)境

- 溫度：哺乳動(dòng)物細(xì)胞一般為 37℃。

- CO?：常用 5% CO?，用于維持培養(yǎng)基中碳酸氫鹽緩沖體系的 pH（約 7.2–7.4）。

- 濕度：培養(yǎng)箱內(nèi)保持 95% 左右 的濕度，防止培養(yǎng)基蒸發(fā)。

2. 培養(yǎng)基與血清

基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如 DMEM、RPMI-1640、MEM 等）提供：

- 氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽、葡萄糖等基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)。

- 酚紅作為 pH 指示劑（黃色偏酸，紫色偏堿）。

完quan培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基 + 血清 + 必要添加物。

血清的作用：

- 提供生長(zhǎng)因子（如 EGF、FGF）。

- 提供貼壁因子，幫助細(xì)胞貼附在培養(yǎng)器皿表面。

- 提供載體蛋白（如白蛋白），運(yùn)輸激素、脂質(zhì)等。

- 緩沖環(huán)境變化，提高細(xì)胞的穩(wěn)定性。

在選擇血清時(shí)，通常關(guān)注：

- 批次間穩(wěn)定性。

- 低內(nèi)毒素、低溶血。

- 無(wú)支原體等微生物污染。

三、無(wú)菌操作與生物安全柜

1. 生物安全柜的使用要點(diǎn)

- 操作前用 75% 乙醇擦拭臺(tái)面。

- 只放置當(dāng)前實(shí)驗(yàn)必需的物品，保持臺(tái)面整潔。

- 所有操作盡量在安全柜的中層區(qū)域進(jìn)行，避免頻繁進(jìn)出。

- 打開(kāi)瓶蓋時(shí)，瓶口朝下傾斜，盡量縮短暴露時(shí)間。

- 操作結(jié)束后再次用 75% 乙醇擦拭臺(tái)面。

2. 無(wú)菌操作原則

- 動(dòng)作要 輕、慢、穩(wěn)，減少空氣擾動(dòng)。

- 避免在安全柜內(nèi)劇烈晃動(dòng)、講話時(shí)正對(duì)操作臺(tái)。

- 所有接觸細(xì)胞的液體和耗材必須是無(wú)菌的。

四、常用耗材與培養(yǎng)器皿

1. 培養(yǎng)器皿

- T 瓶：T25、T75、T175 等，數(shù)字表示培養(yǎng)面積。

- 多孔板：6、12、24、96 孔板，用于不同規(guī)模的實(shí)驗(yàn)。

- 離心管：15 mL、50 mL，用于細(xì)胞收集和重懸。

2. 耗材要求

- 無(wú)菌、無(wú)熱原。

- 貼壁細(xì)胞使用 TC-treated（組織培養(yǎng)處理）的器皿，以利于細(xì)胞貼附。

五、日常操作流程

1. 換液（Feeding）

目的：補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，清除代謝廢物。

貼壁細(xì)胞：

1. 吸棄舊培養(yǎng)基（注意不要吸到細(xì)胞層）。

2. 加入預(yù)熱的完quan培養(yǎng)基。

懸浮細(xì)胞：

1. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，1000 rpm 離心 5 min。

2. 棄上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸。

頻率：一般 2–3 天一次，根據(jù)細(xì)胞密度和培養(yǎng)基顏色調(diào)整。

2. 傳代（Passage）

當(dāng)細(xì)胞達(dá)到 70–90% 匯合度 時(shí)進(jìn)行傳代，以避免接觸抑制和狀態(tài)變差。

貼壁細(xì)胞（胰酶消化法）：

1. 棄上清，用 PBS 輕洗一次。

2. 加入適量 0.25% Trypsin-EDTA，37℃孵育 1–5 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓、開(kāi)始脫落。

3. 加入含血清的完quan培養(yǎng)基終止消化。

4. 輕輕吹打，制成單細(xì)胞懸液。

5. 離心，棄上清，重懸于新鮮培養(yǎng)基。

6. 按比例（如 1:3、1:5）接種到新的培養(yǎng)瓶中。

懸浮細(xì)胞：

- 直接按比例稀釋到新的培養(yǎng)瓶中，必要時(shí)先離心去除死細(xì)胞和碎片。

3. 凍存與復(fù)蘇

凍存步驟：

1. 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，離心。

2. 用凍存液重懸（常用配方：培養(yǎng)基: 血清: DMSO = 7:2:1 或 5:4:1，DMSO 5–10%）。

3. 分裝入凍存管。

4. 放入程序降溫盒，-80℃過(guò)夜，再轉(zhuǎn)入液氮長(zhǎng)期保存。

復(fù)蘇步驟：

1. 從液氮中取出凍存管，迅速放入 37℃ 水浴，1 min 內(nèi)融化。

2. 立即加入大量預(yù)熱的完quan培養(yǎng)基，稀釋 DMSO。

3. 離心，棄上清。

4. 重懸，接種到培養(yǎng)瓶中。

5. 復(fù)蘇后 24 h 內(nèi)盡量不換液，讓細(xì)胞恢復(fù)。

六、污染的識(shí)別與預(yù)防

1. 常見(jiàn)污染類(lèi)型

細(xì)菌污染：

- 現(xiàn)象：培養(yǎng)基渾濁、變黃，顯微鏡下可見(jiàn)大量細(xì)小顆?？焖龠\(yùn)動(dòng)。

- 處理：通常直接丟棄，避免擴(kuò)散。

真菌/酵母污染：

- 現(xiàn)象：培養(yǎng)基中出現(xiàn)絮狀團(tuán)塊或絲狀結(jié)構(gòu)。

- 處理：直接丟棄，徹di清潔培養(yǎng)箱。

支原體污染：

- 現(xiàn)象：培養(yǎng)基外觀正常，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢、形態(tài)異常。

- 危害：影響細(xì)胞代謝、基因表達(dá)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

- 檢測(cè)：PCR、qPCR、熒光染色等。

- 預(yù)防：定期檢測(cè)，使用合格的血清和試劑，嚴(yán)格無(wú)菌操作。

七、細(xì)胞狀態(tài)的日常監(jiān)測(cè)

1. 每天觀察：匯合度、形態(tài)、培養(yǎng)基顏色和是否有異常顆粒。

2. 記錄：傳代次數(shù)、凍存時(shí)間、使用的血清批次等，建立細(xì)胞檔案。

3. 避免過(guò)度傳代：細(xì)胞長(zhǎng)期傳代會(huì)出現(xiàn)基因型和表型漂移，建議使用早期代數(shù)。

八、實(shí)用小技巧

- 新拿到的細(xì)胞系，先查閱 ATCC、Cell Bank 等資料，了解其最jia培養(yǎng)條件。

- 同一細(xì)胞系盡量使用同一批次的血清和培養(yǎng)基，以保證實(shí)驗(yàn)的一致性。

- 建立“備份細(xì)胞庫(kù)"，在細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)多凍存幾管，防止污染或狀態(tài)變差時(shí)“斷檔"。

- 操作時(shí)保持耐心，避免“趕時(shí)間"導(dǎo)致的操作失誤。